ImageJによるCBB SDS-Page ゲルの検量線の作成
アイメジャー有限会社 2009.2.1
■ 準備
・ タンパク質SDS-Pageの一次元電気泳動したゲルをＣＢＢ染色する
・ イメージスキャナ：透過原稿対応スキャナ
セイコーエプソン社製 ES-2000を使用
・
スキャナドライバ：EPSON Scan (Version 3.04J) もしくは、iMeasure Scan（％１）
スキャン時の留意点
「自動露出」をかけないようにする。
そのために、「ドライバによる色補正」をOFFにする。
もしくは、自動露出をかけずに［ＲＥＳＥＴ］ボタンを押すこと。
解像度：３００ｄｐｉ
イメージタイプ：16bit
GrayScale , ドロップアウトカラー Red
・ 電気泳動ゲル解析ソフトウェア：NIH
ImageJ (Version 1.41)
下記ＵＲＬよりダウンロード（フリーウェア）
（％１）スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure Scan
詳細は、下記URLを参照。
http://www.imeasure.co.jp/products-ims-jp.html
■作業
１．
ImageJにてファイルを開く
２．透過率に換算するために最大値を確認する。
Ｌｉｎｅツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze>Plot
Profile (Ctrl+K)
※
8bit データの場合 ：0~255、16bit データの場合：0~65535
※
このファイルは、8bitデータなので、最大値255。
３．イメージタイプを３２ｂｉｔに変更する
Image>Type>32-bit
※
計算誤差を無くすためbit数をあげる。
４．光学濃度に換算する
計算式 【 OD ＝ -1 * (1.8) * ln ( value / 255 )
/ ln(10) 】
※
EPSON Scanner ドライバのデフォルトガンマは、１．８
※
リニアガンマ（＝１．０）でスキャンファイル出力可能であれば１．８は不要。
スキャナ駆動ソフトウェアiMeasure ScanにてDensitometor ONとした場合、スキャナガンマは、１．０となるため計算式の１．８は不要。
詳細は、下記URLを参照。
http://www.imeasure.co.jp/products-ims-jp.html
iMeasure Scan Lite は、vectorからも購入可能となります。（ ￥9,800-税別）
※
ImageJの対数計算式は(Logという表記ですが)、Ln(常用対数)です。自然対数にするため、ln(10)で割る。
４−１．最大値で割る。
Process>Math>Divide
255
４−２．対数変換する
Process>Math>Log
４−３．Ln対数からLog対数に変換
Ln(10)=２．３０２５８５１ で割る。
Process>Math>Divide
2.3025851
４−４． ［１．８］を掛ける
Process>Math>Multiply 1.8
４−５．［−１］を掛ける
Process>Math>Multiply –1
４−６．値を確認する
Ｌｉｎｅツールにてタンパク質のバンドの部分に線を引く。
Analyze>Plot
Profile (Ctrl+K)
※
CBB染色のOD値は、最大でも０．５程度。
５．タンパク質のOD積分値を算出する
５−１．画像を見やすくする
Image>Adjust>Brightness/Contrast
[Ctrl+Shift+C]
Auto ボタンを押す。
B&C
ダイアログのヒストグラムを見ながら、Minimum Maximumスライダーを動かして、「ヒストグラムをはさむ」ようにする。
Brightness,
Contrastは触らないこと。
※
ImageJのBrightness/Contrast による画像操作は、元画像のデータを変更することなく、「見た目」を変えるだけなので、安心して操作する。
※
Applyを押してもオリジナル画像のデータは影響を受けない。
５−２．SDS-Page各レーン（バンド）の狙いのタンパクを囲む
今回は、タンパク質分子量 ５０ＫＤａ を計測した。
５−２−１．レーン＃１を囲む
Analyze>Gels>Select
First Lane (Ctrl+1)
囲った□の中に番号が発生する。
番号の発生した□をブラウスすると、既に複製された□枠が移動する。
５−２−２．レーン＃２を囲む
レーン＃２の、５０ｋＤａのバンドを囲む場所まで移動する。
Analyze>Gels>Select
Next Lane (Ctrl+2)
引き続き、レーン＃３〜レーン＃９まで囲む。
Analyze>Gels>Select
Next Lane (Ctrl+2)
５−２−３． ゲル専用の連続[ Plot Profile ]機能を使う
Analyze>Gels>Plot
Lanes (Ctrl+3)
一度に、全レーンの積分濃度のグラフが連続発生する。
５−３．ＯＤ積分値を算出する
５−３−１．ラインツールを選び、レーン＃１のPlot Profile の山のみの積分値を算出するために、ベースラインを引く。
この時、山の内部が、線で囲まれて「空間が閉じた状態」となるように留意する。
失敗したら、キャンセルして線を引き直す。
※
ゲル画像上下方向の断面が(Plot Profileにて左右に)表示される。
※
ゲル画像左右方向は加算される。
５−３−２．山の面積（ＯＤ積分値）を算出する
魔法の杖（正式名称は不明？）を選び、山の内部を１回クリックする。
直ちに、Results ダイアログが開き、面積の計算値が表示される。
５−３−３．レーン数だけＯＤ積分値を算出する
山が次第に小さくなるので、拡大ツールを使って Plots of .. ダイアログを拡大して、山のベースラインを引く。
６．ファイル保存する
全てのレーンのＯＤ積分値を算出し終えたら、測定値をファイルに保存する。
CSV形式で保存されるので、Excellなどの表計算ソフトで開くことができる。
Result ダイアログ（OD積分値の数値が記載された画面）にて、
File>Save
As
７．検量線を引く
先に保存したOD積分値ファイルをExcellなどの表計算ソフトで開く。
横軸をゲルの各レーンに投入したタンパク質量 [ng/band]
縦軸に、計測したOD積分値 としてグラフを作成する。
近似式を作成し、相関係数を調べる。
相関係数：０．９９３６
※
相関係数が、１から大きくはずれている場合、次の原因が考えられる。
（１）
スキャナの特性が想定外の挙動。
例えば、自動露出が行われていて、勝手にコントラスト強調が行われているなど。
（２）
OD値に換算できていない。（Logの計算が抜けている）
OD値ではなく、スキャナの読み値のままの場合、特に高濃度側（グラフ右側）の点が右肩下がりになる。
以上で基本操作は完了です。 お疲れ様でした。
８．検証
対数軸にして表示。
※最も淡いレーン（7.8ng/band）以外は、信用できる？
OD積分値は、絶対値ではなく相対値である。
つまり、山の面積を算出する度に異なる値となる。
そこで、タンパク質量の相対比は、繰り返し再現性があるかどうか、チェックした。
実験：レーン＃３とレーン＃５のみで解析をして、OD積分値の比率を算出。
レーン３の積分値は、先の値（１８９４）から、４４４８に変わっているが、レーン＃３のOD積分値に対する、レーン＃５のOD積分値は、１８．３％であり、先の実験結果、１８．２％と精度良く一致する。
以上です。
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